버섯은 생태계 내에서 분해자로서 유기물을 무기물로 분해하여 자연에 환원시키는 중요한 역할을 하는 균이다. 또한 버섯 자실체는 맛과 향이 독특하여 식품 및 약용으로 인간에게 이용되어 왔고 근래 재배법 및 기능성 연구 등이 활발히 진행되고 있으며 농가의 중요한 소득원으로 자리잡아 가고 있다. 버섯재배에 영향을 미치는 여러 가지 환경요인 중 종균의 활력은 중요한 문제라고 생각되므로 우량종균의 확보 위한 노력이 필요하다고 본다. 따라서 우량종균 확보를 위한 방법의 하나로서 액체종균의 제조와 이용에 관하여 소개하고자 한다.
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그림 1.스텐레스 배양통(좌;180ℓ)과 공기여과 및 압력조절장치(우) |
(1) 액체종균의 특성
액체종균은 수용액 상태의 살균된 배지에 버섯균을 배양하여 종균으로 사용하는 것을 말한다. 액체배양은 오래 전부터 실험실내에서 정치배양 및 진탕배양을 통하여 균사생장량 조사 등에 활용하고 있었다.
여기에 소개하는 액체종균의 배양 방법은 잘 여과된 압축공기를 넣어주므로써 액체배지와 버섯균의 혼합물이 교반된다. 따라서 균사체에 양분의 접촉이 균일하게 되고 액체상태에서 부족하기 쉬운 산소농도를 높여주는 효과도 있다. 팽이버섯의 경우 톱밥종균 배양기간은 25일정도 소요되나 액체종균은 접종후 5∼7일에 사용할 수 있다(표1).
액체종균은 배양기간이 짧고 균의 활력이 좋아 자가종균 생산을 위하여 유용하다고 생각되나 조작에 세심한 주의가 요구되고 잡균오염 증상 등을 판별할 수 있는 사전 지식과 연습이 필요하다.
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표 1. 액체종균과 톱밥종균의 배양체계 비교
( ) : 톱밥종균
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구 분 |
접 종 원 배 양 |
종 균 배 양 |
종 균 사 용 후 |
소 요 기 간
(일) |
|
배양용기 |
플라스크(링겔병) |
배양병(PP병) |
PP병(PP병) |
|
팽이버섯 |
12 (28) |
5 (25) |
20 (23) |
37 (76) |
|
버들송이 |
15 (30) |
10 (35) |
30 (35) |
55 (105) |
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애느타리 |
10 (23) |
7 (20) |
18 (20) |
35 (63) | | |
| 액체종균 제조시 소요 기자재 |
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작성자: 정종천 / 작성일 :2000-12-01 / 조회수: 430 |
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(가) 소요 기자재
액체종균 제조에 소요되는 시설은 실험실, 배양실이며 배양실은 목적으로 하는 버섯균이 잘 자라는 온도를 유지할 수 있는 것이 좋다. 실험실에 갖추어야 하는 장비는 오토클레이브(소형살균기), 인큐베이터(배양기), 크린벤치(무균상), 호모게나이저(균질기) 등인데 살균기는 배양용기를 넣고 꺼낼 수 있는 용량을 선택하여야 한다. 배양기는 원균 및 접종원의 증식과 보존, 잡균의 검사가 가능하도록 각기 다른 온도를 유지할 수 있도록 준비하여야 한다.
배양용기는 재질별로 1∼20ℓ 내열성유리병, 18ℓ플라스틱 생수통, 100∼250ℓ 스텐레스통을 이용하고 있다. 배양용기의 크기는 적을수록 공기의 주입량도 적어서 잡균의 오염이 적을 것이고 용기가 크면 한 병의 액체종균으로 많은 배지에 접종할 수 있어서 생력적일 것이다. 따라서 용기의 재질이나 크기는 각자의 여건에 따라 선택할 문제이다. 유리병은 비교적 무겁고 파손의 위험이 있으므로 1∼10ℓ가 적당하다.
1ℓLab. bottle은 링겔병을 대체하여 80병 정도의 톱밥종균을 생산할 수 있고, 10ℓ내열성유리병은 배지 800병에 접종이 가능하다. 플라스틱 생수통은 파손이 안되었더라도 균열이 생기므로 연속 사용이 어렵고 고온 고압에 의한 변형이 될 수도 있다. 스텐레스통은 용량이 크므로 주입하는 공기의 여과장치 설비가 필요하며 취급이 어려우므로 내열성 바퀴를 장치하여야 하고 별도의 고압살균기와 분사형 자동접종기도 필요하다.
o 10ℓ들이 내열성 유리병
o 공기 여과 및 주입 장치(실리콘 마개에 조립)
o 열수추출액 10ℓ(감자 1㎏), 설탕 200g, 안티폼 1㎖
o 고압살균기(오토클레이브), 무균상(크린벤치), 균질기(호모게나이저) |
나) 배양용기의 조립
쉽게 조립이 가능한 배양용기의 소요 자재를 표2와 3에 정리하고 그림1에 예시하였다. 액체종균 배양용기의 조립에는 배양병과 병마개가 필요하다. 배양병은 종균의 자람 상태를 관찰할 수 있는 투명한 것으로써 121℃의 고온고압 조건에서 살균하므로 내열성 경질유리병이 좋다.
그림 2. 액체종균 배양용기 조립방법
병마개도 살균시 변형되지 않아야 하고 냉각시에 공기가 새어 들지 않아야 하므로 밀착효과가 좋은 실리콘 제품이 좋다. 병마개에는 4개의 구멍을 뚫어 한가운데를 공기 주입구로 가장자리 3곳을 에어 배출구, 원균 접종구, 종균 채취구로 한다(그림 2).
실리콘마개 각각의 구멍에 스텐레스파이프를 꼭 끼워서 높은 압력에서도 공기가 새지 않게 하여야 하고 파이프의 끝에는 실리콘 튜브를 연결한다. 공기 주입구와 종균 채취구로 하는 파이프는 병 내의 바닥 부위까지 길게하고 원균 접종구와 에어 배출구의 파이프는 마개 밑 부위에서 살짝 나올 만큼 짧게 해야 한다. 공기 주입구와 에어 배출구의 실리콘튜브에는 휠터홀다를 1개씩 달아둔다. 그리고 종균 채취구의 스텐파이프와 실리콘튜브의 직경은 액체종균 이용시에 종균 덩어리가 쉽게 빠져 나오기에 충분하여야 한다.
표 2. 내열성 유리병(10ℓ)을 사용한 액체종균 배양용기 소요자재
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소 요 자 재 |
규 격 |
포장단위 |
1병당 소요량 |
용 도 |
|
유 리 병 |
내열성(13ℓ) |
... |
1 개 |
배지살균,종균배양 |
| 실 리 콘 마 개 |
NO 20 |
.. |
1 개 |
병 마개 |
|
실 리 콘 튜 브 |
3×6mm |
10 m |
15cm 1개 |
공기 주입구 |
|
실 리 콘 튜 브 |
5×8mm |
10 m |
1m 1개, 15cm 1개 |
액체종균 배출구 |
|
실 리 콘 튜 브 |
6×11mm |
10 m |
1m 1개 |
접종원 투입구 |
|
스텐레스파이프 |
3.5×5mm |
4 m |
42cm 1개 |
공기 주입구 |
|
스텐레스파이프 |
6×8mm |
4 m |
42cm 1개, 8cm 2개 |
종균주입, 배출구 |
|
휠 터 홀 다 |
직경 25mm용 |
12 개 |
2개 |
휠터paper 조립용 |
|
휠 터 paper |
0.2㎛, 25mm |
100 매 |
1 장 (소모품) |
공기 주입구 내측 |
|
휠 터 paper |
pre, 25mm |
200 매 |
1 장 (소모품) |
공기 주입구 외측 |
|
휠 터 paper |
0.45㎛, 25mm |
100 매 |
1 장 (소모품) |
공기 배출구 |
|
핀 치 코 크 |
집게형 |
100 개 |
5 개 |
살균시 튜브 밀폐 |
|
안 티 폼 |
Sigma A-5551 |
100 ㎖ |
1㎖ (소모품) |
거품방지제 |
|
에 어 펌 프 |
3 W |
어항용 |
1개 |
공기주입 배지혼합 |
|
T 자 밸 브 |
외경 6∼8mm |
10 개 |
.. |
살균시 공기유입 |
|
체 크 밸 브 |
외경 6∼8mm |
10 개 |
1 개 |
공기 역류 방지 |
|
교 반 기 |
대산 MS |
1 대 |
.. |
균덩이 형성 방지 |
|
마 그 네 틱 바 |
OWIE 001.538 |
10 개 |
1 개 |
균덩이 형성 방지 |
표 3. 시약병(2ℓ)을 이용한 액체종균 배양용기 소요자?
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소 요 자 재 |
규 격 |
포장단위 |
1병당 소요량 |
용 도 |
|
시 약 병 |
Pyrex(2ℓ) |
10 병 |
1 병 |
배지살균, 종균배양 |
|
실 리 콘 마 개 |
NO 11 |
낱개 |
1 개 |
병 마개 |
|
실 리 콘 튜 브 |
3×6mm |
10 m |
10cm 3개 |
공기 주입구 |
|
실 리 콘 튜 브 |
5×8mm |
10 m |
1m 1개 |
액체종균 배출구 |
|
스텐레스파이프 |
3.5×5.0mm |
4 m |
28cm 1개 |
공기 주입구 |
|
스텐레스파이프 |
5.0×6.5mm |
4 m |
28cm 1개, 5cm 2개 |
종균주입, 배출구 |
|
휠 터 홀 다 |
직경 25mm용 |
12 개 |
2 개 |
휠터paper 조립용 |
|
휠 터 paper |
0.2㎛, 25mm |
100 매 |
1 장(소모품) |
공기 주입구 내측 |
|
휠 터 paper |
pre, 25mm |
100 매 |
1 장(소모품) |
공기 주입구 외측 |
|
휠 터 paper |
0.45㎛, 25mm |
100 매 |
1 장(소모품) |
공기 배기구 |
|
핀 치 코 크 |
집게형 |
100 개 |
5 개 |
살균시 튜브 밀폐 |
|
안 티 폼 |
Sigma A-5551 |
100 ㎖ |
1㎖ (소모품) |
거품방지제 |
|
에 어 펌 프 |
3 W |
어항용 |
1 개 |
공기주입 배지혼합 |
|
T 자 밸 브 |
외경 6∼8mm |
10 개 |
1 개 |
살균시 공기배출 |
|
체 크 밸 브 |
외경 6∼8mm |
10 개 |
1 개 |
공기 역류 방지 |
|
교 반 기 |
대산 MS |
1 대 |
\ |
균덩이 형성 방지 |
|
마 그 네 틱 바 |
COWIE 001.538 |
10 개 |
1 개 |
균덩이 형성 방지 | | |
(가) 액체배지의 조제
액체종균 배양에 사용할 배지는 버섯균이 자라는 데 충분한 양분을 함유하고 있으면서 잡균의 오염을 쉽게 식별할 수 있도록 액체배지의 투명도가 높은 것이 좋다. 감자추출배지는 추출작업이 번거롭기는 하지만 원균 증식용으로 사용하고 있는 PDA배지와 성분이 같고 배지의 투명도가 높아 균사생장과정 및 잡균오염을 관찰하기가 용이하여 편리하다.
팽이버섯의 경우 감자추출배지 조제 방법은 액체배지 10ℓ당 껍질을 제거한 생감자 1㎏을 잘게 썰어 망사주머니에 넣고 열수추출한 후 건져낸다. 배양용기에 설탕 200g을 넣어 녹이고 거품 방지제로서 안티폼(Sigma제품; Antifoam289) 1㎖를 넣어 준다. 이 경우 배지의 pH는 6.0∼6.5 정도로 팽이버섯, 버들송이버섯의 경우 산도 조정이 요구되지 않으나 느타리, 애느타리는 추출배지의 pH를 4.0∼4.5 정도로 조정하여야 압축공기를 이용한 액체배양시 균사생장량이 많아지게 된다.
* 추출배지 10ℓ에 1N-HCl을 약 30ml 넣으면 pH 4.0∼4.5
* HCl 시약(35%) 89 ml + 증류수 911ml = 1N-HCl 1ℓ |
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그림 3. 액체종균 배양 실험광경과 이용효과 |
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액체배지의 pH에 따른 느타리버섯의 균사생장(좌로부터 pH 4, 5, 6) |
팽이버섯 액체종균 접종효과(접종 18일째; 왼쪽-액체종균, 오른쪽-톱밥종균) |
감자추출배지 보다는 균배양 속도가 더디지만 시약이나 분말을 이용한 간편한 배지로는 대두박 배지와 하이포넥스 배지를 이용할 수 있다. 대두박은 콩기름 공장의 부산물로 지방이 제거된 것인데 입자가 크므로 곱게 빻아서 물 10ℓ당 30g과 황백당 300g, 인산가리 10g, 황산마그네슘 5g를 넣고 첨가된 시약을 잘 녹인 후 안티폼 1㎖을 넣어 살균한다. 하이포넥스는 액상의 원예용 4종 복합비료로써 물 10ℓ당 30㎖을 넣고 설탕 300g, 펩톤 30g 녹이고 안티폼 1㎖을 넣어 살균한다(표 4).
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표 4. 버섯류 액체종균 배양용 배지종류
(물 10ℓ당)
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배지 종류 |
배지재료 첨가량 |
대상버섯 |
출 처 |
비 고 |
| 감자추출배지 |
감자 1kg 추출액
설탕 200 g
안티폼(Sigma A-5551)1㎖
*느타리류는 살균전 배지
pH를 4.0으로조정 |
팽이버섯,
버들송이, 느타리,
애느타리, (동충하초) |
'95∼'97농과원 |
가장 이상적이나 감자추출이 번거로움. |
| 대두박배지 |
대두박 30g
황설탕 300g
KH2PO4 5g
MgSO4·7H2O 5g
식물성 식용유 30㎖ |
느타리,(팽이버섯)
(동충하초) |
'97 강원대 |
o 대두박은 식용유 부산물.
o 비용이 저렴
o 식용유는 안티폼1㎖ 대체 가능 |
| Hyponex배지 |
설탕 300g
Peptone 30g
하이포넥스 30㎖
안티폼(Sigma A-5551)1㎖ |
(팽이버섯)
(느타리) |
..... |
.... |
|
액체배지의 조제가 끝나면 가급적 빠른 시간 내에 살균을 하여야 한다. 살균기에 넣기 전에는 배양용기의 실리콘마개에 있는 파이프 4개의 개폐 조작이 매우 중요하다. 공기 주입구, 에어 배출구, 종균 채취구는 파이프 끝에 연결된 실리콘튜브의 끝 부분을 알미늄 호일로 싸서 구부린 후 핀치코크를 끼워서 막고 원균 접종구는 열어두어야 살균시 용기내의 팽창된 공기를 내어 보냄으로써 용기의 파손 또는 실리콘마개의 이탈을 방지할 수 있다. 액체배지의 살균은 살균기내의 온도 121℃, 압력 1.2㎏/㎠에서 60분간이면 충분하고 너무 장시간 살균을 하면 액체배지의 양분이 분해되어 버섯균의 생장이 지연되게 된다.
살균이 끝나고 살균기내의 온도가 99℃ 정도로서 압력계가 0을 나타낼 때 살균기의 문을 여는 즉시 살균시에 열어 두었던 원균 접종구의 실리콘튜브 끝을 막아야 한다. 용기의 내부는 온도가 하강함에 따라 액체배지와 공기의 밀도가 수축되므로 외부공기의 흡입에 의한 잡균오염의 원인이 되기 때문이다.
그러나 플라스틱 생수병을 이용할 경우 살균 후 밀폐해 두면 수축공기로 인하여 용기가 변형되므로 원균 접종구의 실리콘튜브 끝에 T밸브를 달아서 양쪽에 공기거름 필터를 장치하여 살균 전에는 한쪽을 막아 두고 살균 후 반대로 열어서 병 내에 진공이 생기기 않도록 한다(그림 4).
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그림 4. 액체종균 배양병의 T밸브와 체크밸브 연결 |
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T밸브(살균 전후 조작) |
체크밸브(배양시 공기 역류방지) |
(나) 액체종균의 배양
살균기에서 배양용기를 꺼낼 때는 마개의 파이프에 연결된 실리콘튜브 4개가 모두 밀폐된 상태로써 살균된 액체배지가 접종원균을 접종하기에 알맞은 온도인 20℃ 정도로 냉각될 때까지 용기의 내부는 거의 진공상태가 된다. 따라서 접종원을 접종하기 전에 배양용기 내부의 진공을 해제해 주어야 하는데 이것은 액체종균 배양의 성패를 좌우하는 매우 중요한 과정이다. 공기 주입구에는 0.2㎛ 휠터가 끼워져 있으므로 이것을 막고 있는 핀치코크를 살짝 열어 외부의 공기가 서서히 여과되면서 용기 내부로 흘러 들어가도록 해준다. 그러면 공기방울에 의하여 용기내의 액체배지가 끓어오르는 것처럼 된다.
용기내부의 진공상태가 완전히 해제되면 미리서 삼각플라스크의 액체배지에 배양해 두었던 접종원을 호모게나이저로 갈아서 원균 접종구를 통하여 넣어준다. 이때는 기구나 작업과정을 통한 잡균의 침입을 방지할 수 있는 충분한 조치가 선행되어야 한다. 그리고 접종원이 용기내로 쉽게 흘러들어 가도록 하기 위하여 에어 배출구를 열어두어야 한다.
접종원의 투입이 끝난 배양용기는 공기 주입구를 통하여 압축공기를 넣어주고 에어 배출구의 휠터를 통하여 빠져나갈 수 있도록 하고 나머지 2개의 파이프는 막아둔다. 배양실의 온도는 균이 잘 자라는 온도로 조절한다. 팽이버섯의 경우 22∼24℃의 범위에서 균이 잘 자라나 톱밥종균의 경우 병 내부의 호흡열을 감안하여 배양실의 온도를 16℃ 내외로 유지하는 것이 일반적이나 액체종균의 경우는 호흡열의 방열이 잘 이루어지므로 22∼24℃로 유지하는 것이 좋다.
| 액체종균의 이용효과 |
|
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작성자: 정종천 / 작성일 :2000-12-01 / 조회수: 257 |
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팽이버섯의 경우 살균된 액체배지에 액체접종원을 접종한 후 0.2㎛ 휠터로 여과된 압축공기를 넣어 5∼7일간 배양하면 톱밥배지에 접종할 수 있다. 그러나 10일을 경과하면 균덩이가 커져서 종균 채취구를 쉽게 통과하지 않으므로 7일경에 남은 배양병을 4℃정도의 저장실에 1주일 이내로 저장하여 두고 사용한다. 톱밥배지는 일반적으로 고압 살균시에 배지표면의 수분이 2∼4% 정도 증발된다고 하는데 액체배지의 접종은 톱밥배지의 표면에 수분을 보충해 주는 효과도 있을 것이다. 그러나 액체종균의 접종량이 너무 많으면 과습으로 인하여 배지내로 공기 유통이 잘 안되어 오히려 불리하게 될 수도 있다. 따라서 액체종균의 알맞는 접종량은 톱밥배지 850㎖ 병당 10㎖ 정도이다(표5∼7). 접종 방법은 크린벤치를 활용하여 2인 1조로 작업하면 수작업으로도 1,000병을 30분에 접종할 수 있다. 최근에는 고압 분사 노즐을 이용한 액체종균 접종기가 개발되어 활용하고 있는 곳도 있다.
표 5. 팽이버섯 액체종균 접종량이 균배양 및 버섯생장에 미치는 영향
|
액체종균 접종량
(㎖/850㎖) |
배양기간
(일) |
잡균발생비율
(%) |
자실체 수량
(g/병) |
|
2 ( 4 )
5 (10)
7 (14)
10 (20)
15 (30)
대조(톱밥종균) |
25
23
22
20
20
21 |
3
2
0
0
0
0 |
135
140
149
150
138
147 |
표 6. 액체종균 접종량에 따른 버들송이 자실체 수량
|
액체종균 접종량
(㎖/850㎖) |
배양기간
(일) |
배양완성율
(%) |
자실체 수량
(g/850㎖) |
|
5
10
15
20
30
대조(톱밥종균) |
35
30
28
27
30
35 |
85
92
90
88
85
75 |
108
122
121
109
109
111 |
|
표 7. 느타리버섯 액체종균 접종방법 및 접종량에 따른 배양기간과 수량
|
접종방법 |
접 종 량
(ℓ/㎡) |
접종후 배지
표면수분(%) |
균사활착
소요기간(일) |
수 량
(㎏/㎡) |
|
표면접종 |
0.5 (1.3)
1.0 (2.6)
1.5 (3.9)
2.0 (5.2) |
75.1
77.6
79.4
81.6 |
22
19
20
21 |
7.3
9.3
6.9
6.1 |
|
대조(톱밥종균) |
73.7 |
16 |
9.5 |
|
혼합접종 |
0.5 (1.3)
1.0 (2.6)
1.5 (3.9)
2.0 (5.2) |
74.5
75.1
75.6
76.1 |
21
19
18
18 |
8.1
10.1
10.4
10.6 |
|
대조(톱밥종균) |
73.7 |
14 |
10.1 |
|
액체종균 이용효과 및 사용상의 문제점
○ 액체종균의 이용 효과
(1) 버섯 균의 활력을 유지함으로써 지속적인 안정생산에 기여
(2) 실험실에 갖추어진 크린벤치, 소형살균기, 인큐베이터 등의 활용 극대화
(3) 종균으로서 소모되었던 약 2%의 톱밥종균이 버섯생산에 추가
(4) 배양기간과 발이기간이 단축되어 시설 이용율이 약 9% 향상
○ 액체종균 이용상의 문제점
(1) 액체종균에 대한 사전실습 등 준비없이 시작하여 피해 사례가 있음.
(2) 액체종균의 과다량 접종은 배지표면의 과습으로 배양의 지연을 초래함.
(3) 대용량의 탱크 배양은 공기여과 및 액체배지의 유동이 성공의 관건임.
(4) 배양된 액체종균의 검사과정 없이 접종함으로 인하여 배지를 전량 폐기하기도 함. |
맺음말
액체종균의 이용은 좋은 설비와 숙련된 기술이 필요하지만 활력이 높은 버섯균의 생산이 가능하므로 병재배농가, 종균배양소, 배지배양센타 등에서 자가종균 확보 방법으로써의 활용이 기대된다. | | |
