(자료제공=광주버섯시험장)
< PDA 제조 >
(1) 감자를 씻은 후 껍질을 벗긴다. 감자 눈을 잘 도려내고 대략 사방 1㎝로 잘라 200g/ℓ가 되도록 한다(a).
(2) 삼각플라스크나 용기에 증류수 또는 수돗물 1000㎖에 (1)번과 같은 감자를 넣은 후에 30분~1시간 정도 찐다(b).
(3) 가아제를 2~3매 겹쳐서 여과하든지 또는 (2)번의 액이 식을 때까지 정치한 후 가라앉은 찌꺼기가 들어오지 않도록 서서히 별도 용기에 부어서 사용할 수 있다(c).
(4) 여과된 액이 1000㎖가 되도록 증류수나 수돗물로 보충하여 채우고 배지성분과 한천 20g을 넣는다(d).
(5) 다시 끓여서 한천을 녹인 후 (e)에 분주기로 시험관에 적당량(15㎖정도) 분주한다(e).
(6) 고압멸균(121℃, 15~20분간) 후 굳기전(50℃ 이하에서 굳음)에 비스듬하게 눕혀 사면 시킨다.
Autoclave를 너무 빨리 열면 배지가 분출되는 일이 있으며 면전이 빠지면 어떠한 경우에도 그 시험관을 사용해서는 안된다.
▶ 그림 2 참조
[그림 2] PDA 제조 및 멸균법
<고체(톱밥)배지 조제법>
(1) 단일 수종 톱밥을 준비한다(a).
(2) 메쉬체로 분류하여 입자 크기를 정리한다. 입자크기는 시험목적에 따라 다르나 20~30 메쉬가 좋다(b).
(3) 첨가 영양원을 준비한다. 일반적인 영양원으로 미강, 밀기울, 콩비지 등이 많이 이용된다(c).
(4) 톱밥과 영양원을 혼합한다. 혼합비율은 용량비로 톱밥 3~10에 대하여 영양원을 1 비율로 한다(d).
(5) 물을 첨가하여 충분히 섞는다. 함수율이 65% 정도 되도록 조절한다. 손으로 배지를 꽉 쥐어서 손가락 사이로 물이 스며 나오면 적당하다(e).
(6) 시험관(직경 25~30㎜)과 배양병에 균일하게 채워서 상하 밀도가 균일하도록 한다(f).
(7) 시험관 또는 병을 거꾸로 하여 배지 표면까지의 내벽을 수세하고 부착한 배지를 씻어낸다. 배지에 물이 들어가지 않도록 주의한다(g).
(8) 면전등으로 마개를 하고 Autoclave를 사용해서 121℃에서 40~60분간 멸균한다(h).
(9) 톱밥은 미생물 약품류등에 오염되어 있지 않은 것이 좋으며 벌채 직후 톱밥은 약 1개월 방치하여 페놀성분을 방산시키는 것이 좋다.
(10) 톱밥의 수종은 포플러과에 속하는 활엽수 톱밥이 적당하나, 삼나무, 소나무류 등의 침엽수 톱밥도 사용된다. 특히 침엽수 톱밥은 반년~1년간 실외에 퇴적하여 휘발성 물질을 방산시켜서 사용하는 것이 좋다.
(11) 시험 목적에 따라 pH 조절을 위해 탄산칼슘을 용량비로 약 1% 첨가하고 기지로서 톱밥 이외에 보수성 다공질 소재도 사용될 수 있다.
[그림 3] 톱밥배지 제조방법
<균의 접종 및 배양법>
1. Clean bench(무균상)사용법
시설하는데 무균실보다 값이 적게 들고 사용하기가 편리하다. 물론 무균실에 Clean bench를 놓으면 좋으나 장시간 일을 하는 경우는 보통 실험실에 두는 편이 편리하다.
무균상은 여과한 공기를 끊임없이 계속하여 보내기 때문에 사용하기에 어려운 점은 없으나 다음과 같은 점에 주의한다.
(1) 사용하기 전에 창을 닫은 후 에어콘을 끄고 실내에 남아있는 공기 흐름을 억제한다.
(2) 개개 균의 무균조작을 시작하기 전에 반드시 무균상을 비운채로 운전한다. 예를 들면 균주가 다른 균이라도 동일한 표고균이면 연속하여 접종해도 좋으나, 맛버섯과 같이 분생포자를 다량 만드는 균을 취급한 후에는 다음균을 취급할 때까지 15분 이상을 비운 채로 운전한다. 세균과 불안전균의 오염은 비교적 빨리 알 수 있으나 담자균끼리의 오염은 발이할 때까지 알아차리지 못하는 경우가 있다.
(3) Clean bench는 항상 무균조작을 하는 곳이기 때문에, 무균상 내는 항상 청결하여야 하며 물건을 방치해서는 안 된다. 무균상태는 필터 내를 통한 직후의 공기만 보증할 수 있다는 것을 잊어서는 안된다.
